Проточна цитофлуориметрия – це цитологічний метод досліджень, що застосовується для поглибленого аналізу клітин. Його перевагою є те, що він дозволяє вивчити кожну клітину окремо. Даний вид аналізу допомагає зробити оцінку декількох параметрів у сотень клітин за лічені секунди. Завдяки цьому цитофлуориметрия вважається одним з найбільш швидких і точних методів аналізу, які доступні вченим і клініцистам в даний час.

Принцип

Принцип методу проточної цитофлуориметрии заснований на вимірюванні розсіювання світла і світіння (флуоресценції) клітин. Клітинну суспензію пропускають у вигляді потоку з великою швидкістю через клітинку цитометра, де відбувається її опромінення лазером. Там же проводиться, так звана гідродинамічна фокусування. Її механізм полягає в тому, що потік з комірки з досліджуваними частками на виході вливається в зовнішню струмінь, яка володіє більшою швидкістю. В результаті відбувається вибудовування частинок в упорядковану ланцюжок.

Попередньо клітини мітять спеціальними флуоресціюючими барвниками (флуорохромами). Завдяки їм лазерний промінь збуджує вторинне світіння. Отримані світлові сигнали реєструються детекторами. У подальшому інформація обробляється за допомогою програмних алгоритмів, які дозволяють підрахувати окремі популяції клітин, що розрізняються за якими-небудь критеріями.

Дослідження з допомогою традиційної мікроскопії часто не дозволяє відрізнити різні клітини, так як вони виглядають однаково. Цитофлуориметрия може надати і інші дані (цілісність структури ДНК), провести аналіз експресії білків, виживаності клітин.

Так як для порушення флурохромів потрібні світлові промені з різною довжиною хвилі, а також різні типи детекторів, то сучасні установки оснащені декількома каналами детекції (від 4 до 30). Кількість лазерних випромінювачів може бути від 1 до 7. Більш складні за складом пристрої дозволяють здійснювати багатопараметричні дослідження відразу декількох властивостей частинок.

Переваги і недоліки

До переваг проточною цитофлуориметрии відносяться наступні:

• висока швидкість обробки (реєстрація до 30 тисяч подій за 1 секунду);
• можливість дослідження великого числа клітин (до 100 млн. в зразку);
• кількісна оцінка інтенсивності флуоресцентного випромінювання;
• аналіз кожної з клітин;
• одночасне дослідження різнорідних процесів;
• автоматичне розділення даних по популяції клітин;
• якісна візуалізація результатів.

Ще однією особливістю цієї технології є те, що анализируемую частку допускається фарбувати кількома флуоресцентними розчинами. Завдяки цьому відбувається многопараметрическое дослідження.

До недоліків можна віднести складність технічного обладнання і необхідність спеціальної підготовки проби.

Цитометры

Перші пристрої такого типу з’явилися вже в 1968 році в Німеччині, але широкого розповсюдження вони отримали набагато пізніше. В даний час всі прилади, що працюють за методом проточної цитофлуориметрии, можна розділити на 2 типи:

• пристрої, що вимірюють флуоресцентне випромінювання (дві і більше довжини хвилі), розсіяння світла під кутом 10 і 90° (детектор малокутового і бічного розсіювання);
• апарати, які, крім вимірювання декількох клітинних параметрів, що автоматично виробляють сортування на групи у відповідності з цими критеріями.

Детектор прямого світлорозсіювання призначений для визначення розмірів клітини, а пристрій для реєстрації бічного світлорозсіювання дозволяє отримати інформацію про наявність внутрішньоклітинних гранул, об’ємного співвідношення цитоплазми і ядра.

Класичні цитометры, на відміну від світлових мікроскопів, не дозволяють отримати зображення клітини. Однак в останні роки розроблені комбіновані пристрої, які здатні поєднувати можливості мікроскопа і цитофлуориметра. Мова про них піде нижче.

Візуалізаційні цитометры

Для приладів, які використовуються в класичній проточною цитофлуориметрии, характерна одна особливість: якщо в популяції аналізованих клітин зареєстровані рідкісні події, то немає можливості оцінити, яка їх суть. Ці частинки можуть виявитися як останками померлих клітин, так і їх рідкісною групою. У звичайних апаратах такі дані виключаються із загального потоку подій, проте саме вони можуть представляти особливу цінність для наукового і клінічного аналізу.

Візуалізаційні проточні цитометры нового покоління дозволяють зафіксувати зображення кожної клітини, що проходить в потоці через зону детектора. Його легко побачити, натиснувши на відповідну область діаграми, яка виводиться на монітор комп’ютера.

Сфери застосування

Проточна цитофлуориметрия – універсальний метод, який застосовується в багатьох областях медицини і науки:

• імунологія;
• онкологія;
• трансплантологія (трансплантація червоного кісткового мозку, стовбурових клітин);
• гематологія;
• токсикологія;
• біохімія (вимірювання кислотності всередині клітини, дослідження інших параметрів);
• фармакологія (створення нових ліків);
• мікробіологія;
• паразитологія та вірусологія;
• океанологія (вивчення фітопланктону для оцінки стану водойм та інші завдання);
• нанотехнології та аналіз мікрочастинок.

Імунологія

Імунна система людини складається з великої кількості різноманітних клітин. Проточна цитофлуориметрия в імунології дозволяє оцінити їх структуру і функції, тобто провести морфофункциональный аналіз.

Такі дослідження допомагають вивчити складну природу імунітету. Фенотип клітин змінюються в результаті активації антигенами, розвитку патологій та інших факторів. Цитофлуориметрия може розділити субпопуляції імунних клітин у складній суміші і оцінити всі їх зміни в динаміці.

Онкологія

Однією з найважливіших завдань в онкології є диференціювання клітин за їх типом. Принцип аналізу за методом проточної цитофлуориметрии в онкогематології заснований на наступне явище: при обробці проби спеціальним флуоресцентним барвником відбувається його зв’язування з білками цитоплазми. Після поділу в активно проліферуючих клітинах відбувається зниження його вмісту в два рази. Відповідно, дворазово зменшується і інтенсивність світіння клітин.

Існують і інші способи виявлення проліферуючих клітин:

• використання ДНК-зв’язуючих барвників (йодид пропидия);
• застосування міченого урацилу;
• реєстрування підвищеного рівня експресії білків циклинов, які беруть участь у регуляції клітинного циклу.