Хроматографія – це один з методів розділення речовин. Вона використовується для подальшого якісного і кількісного аналізу фізичних і хімічних властивостей мікрочастинок. Різновидом даної технології є аффинная хроматографія. Ідея диференціації білкових сполук з використанням властивості спорідненості молекул відома в науці вже кілька десятиліть. Однак свій розвиток вона отримала тільки в останні роки, після того, як були впроваджені високопористі гідрофільні матеріали, що використовуються в якості матриці. Даний метод дозволяє вирішувати як аналітичні задачі (поділ речовин та їх ідентифікація), так і препаративні (очищення, концентрування).

Сутність

Аффинная хроматографія (від латинського слова affіnіs – «суміжний», «споріднений») заснована на афінних взаємодіях, які являють собою утворення високо специфічних зв’язків між молекулою-роздільником (лігандом або аффинантом) і цільової молекулою. Ці механізми широко поширені в природі (зв’язок медіаторів або гормонів і рецепторів, антитіл і антигенів, гібридизація полінуклеотидів та інші види процесів). У медицині аффинная хроматографія почала застосовуватися в практичних цілях починаючи з 1951 р.

Поділ компонентів відбувається наступним чином:

• робочий розчин, що містить речовину, яку необхідно виділити, пропускають через сорбент;
• ліганд, нанесений на матрицю-сорбент, утримує це речовина;
• відбувається його концентрування (накопичення);
• вилучення виділеного речовини з сорбенту за допомогою вимивання розчинником.

Даний спосіб дозволяє виділити цілі клітини. Відмінністю від традиційної сорбційної хроматографії є те, що існує міцне биоспецифическое зв’язування виділяється компонента з сорбентом, що характеризується високою вибірковістю.

Адсорбенти

В якості адсорбентів застосовують такі речовини:

• Гелевидні склади на основі агарози – полісахариду, одержуваного з агару. Найбільш часто використовують 3 різновиди: сефарозу 4, CL (зшита агароза) і аффи-гель. Останній склад являє собою модифікований гель з агарози та поліакриламіду. Він володіє більшою біологічною інертністю, високою хімічною і термічною стійкістю.
• Кремнезем (силікагель).
• Скло.
• Органічні полімери.

Для усунення механічних перешкод при контакті ліганду застосовують додаткові речовини, що відокремлюють його від носія (пептиди, диамины, поліаміни, олігосахариди).

Апаратура

Обладнання для афінної хроматографії включає в свій склад наступні основні вузли:

• ємкості-накопичувачі для рухомої фази (елюентів);
• насоси високого тиску для подачі середовища (найчастіше поршневі);
• фільтр для очищення елюентів від пилу;
• дозуючий пристрій;
• хроматографічний колона для розділення суміші;
• детектор для визначення розділених компонентів, що виходять з колони;
• реєстратори хроматограмм і мікропроцесорний блок (ЕОМ).

З метою зменшення кількості розчиненого повітря через рухливу фазу попередньо пропускають гелій. Для зміни концентрації елюентів встановлюють кілька насосів, керованих програматором. Хроматографічні колони виготовляються з нержавіючої сталі (при підвищених вимогах до корозійної стійкості), скла (універсальний варіант) або з акрилу. Для препаративних цілей їх діаметр може коливатися від 2 до 70 див. В аналітичній хроматографії застосовують микроколонки Ø10-150 мкм.

Для підвищення чутливості детекторів в суміш вводяться реагенти, які сприяють утворенню речовин, які більше поглинають промені в ультрафіолетовій або видимій області спектра.

Методика проведення

Розрізняють 2 основних види рідинної афінної хроматографії:

• Колоночная, при якій колону заповнюють нерухомою фазою і через неї пропускають суміш з потоком елюентів. Поділ може відбуватися під тиском або під внаслідок дії сили тяжіння.
• Тонкошарова. Елюенти рухається по плоскому шарі адсорбенту під впливом капілярних сил. Адсорбент наносять на пластину зі скла, керамічний або кварцову паличку, металеву фольгу.

Основні етапи робіт включають в себе:

• підготовка адсорбенту, фіксація ліганду на носії;
• подача суміші для поділу в хроматографічну колону;
• завантаження рухомої фази, зв’язування компонента лігандом;
• заміна фази для виділення пов’язаного речовини.

Призначення

Аффинная хроматографія використовується для виділення наступних видів речовин (у дужках зазначений вид застосовуваного при цьому ліганду):

• аналоги інгібіторів ферментативних, субстратів і кофакторів (ферменти);
• біоорганічні речовини, що володіють ознаками генетичної чужорідності, віруси і клітини (антитіла);
• високомолекулярні вуглеводи, полімери моносахаридів, глікопротеїни (лектини);
• ядерні білки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеїнові кислоти);
• рецептори, транспортні білки (вітаміни, гормони);
• білки, що взаємодіють із клітинними мембранами (клітини).

Ця технологія також використовується для одержання іммобілізованих ферментів, а прив’язка їх до целюлозі дозволяє виготовити імуносорбенти.

Хроматографія ДНК-зв’язуючих білків

Виділення ДНК-зв’язуючих білків здійснюється за допомогою гепарину. Цей глікозаміноглікан здатний зв’язувати великий діапазон молекул. Аффинная хроматографія білків цієї групи використовується для виділення таких речовин, як:

• фактори ініціації і елонгації трансляції (синтез молекул нуклеїнових кислот і білків);
• рестриктази (ферменти, які впізнають певні послідовності в дволанцюжкової ДНК);
• ДНК-лігази і полімерази (ферменти, що каталізують з’єднання двох молекул з утворенням нового хімічного зв’язку і беруть участь у реплікації ДНК);
• інгібітори серинових протеаз, які відіграють важливу роль в імунних і запальних процесах;
• фактори зростання: фібробластів, Шванна, ендотеліальний;
• білки міжклітинного матриксу;
• рецептори гормонів;
• ліпопротеїди.

Переваги

Даний метод є одним з найбільш специфічних для виділення реакційноздатних сполук (ферментів і більш великих агрегатів – вірусів). Проте він використовується не тільки для виділення біологічно активних речовин.

Виявлення антитіл в малих кількостях, кількісна оцінка полиадениловой кислоти, експрес-визначення молекулярних мас дегідрогеназ, видалення певних забруднювачів, вивчення кінетики активації неактивної форми трипсину, молекулярної будови інтерферонів людини – ось далеко не весь перелік досліджень, при яких застосовується аффинная хроматографія. Застосування в клініці обумовлено такими її перевагами, як:

• Можливість ефективного очищення білків, полісахаридів, нуклеїнових кислот. Вони дещо відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями і втрачають свою активність при гідролізі, денатурації та інших видах впливу, що використовуються в інших методах.
• Швидкість розділення речовин, динамічний характер процесу.
• Відсутність необхідності в спеціальному очищенню ферментів і гомогенізації ізоферментів для визначення констант дисоціації.
• Можливість поділу широкого кола речовин.
• Невеликий витрата лігандів.
• Можливість поділу речовин у великих обсягах.
• Оборотний процес зв’язування біологічних макромолекул.

Дану методику можна поєднувати з іншими, накладати додаткове поле (гравітаційне, електромагнітне). Це дозволяє розширити технічні можливості хроматографії.

Ферментна інженерія

Завдяки цьому методу почався активний розвиток нової галузі біотехнологій – ферментної інженерії.

Аффинная хроматографія стосовно виділення ферментів володіє наступними перевагами:

• отримання ферментів у великих кількостях в результаті менших затрат часу, як результат – їх здешевлення;
• іммобілізація ферментів дозволяє значно розширити область їх застосування в медицині та промисловості;
• зв’язок ферментів з нерозчинної твердою підкладкою дає можливість вивчити вплив мікрооточення і напрямок реакцій, які грають важливу роль в природних і фізіологічних процесах.